Validierung mikrobiologischer Methoden - Was muss ich beachten?

Wenn es um die Eignung von mikrobiologischen Prüf- und Testverfahren im Bereich der mikrobiologischen Qualitätskontrolle oder gegebenenfalls Qualitätssicherung geht,  stellen sich eine Reihe von Fragen, z. B.

• Wann muss ich eine Methode validieren?
• In welchen Fällen ist das nicht in vollem Umfang nötig und es reicht ein Eignungstest (Suitability Test)?
• Wie gehe ich bei der Validierung vor bzw. wo finde ich Vorgaben oder Informationen dazu?

1. Suitability Test

Einen ersten Anhaltspunkt liefert die Europäische Pharmakopöe in  Ph. Eur. 1. General Notices zum Thema Validierung von Arzneibuchmethoden:
"Die in Monografien und allgemeinen Kapiteln angegebenen Prüfverfahren wurden gemäß anerkannten wissenschaftlichen Verfahren und aktuellen Empfehlungen zur analytischen Validierung validiert. Sofern in der Monografie oder im allgemeinen Kapitel nichts anderes angegeben ist, ist eine Validierung der Prüfverfahren durch den Analytiker nicht erforderlich."(Übers. Redaktion)

Allerdings befreit das nicht von der Verpflichtung, die Eignung der verwendeten Methode für den Einsatzzweck nachzuweisen, d. h. einen Suitability Test durchzuführen. Das bedeutet, es wird eine Eignungsprüfung einer mikrobiologischen Arzneibuchmethode durchgeführt, um zu belegen, dass das standardisierte Verfahren (z. B. nach Ph. Eur. oder nach United States Pharmacopoeia (USP)), im eigenen Labor und in Gegenwart des spezifischen Produkts, für den beabsichtigten Zweck geeignet ist. Klassische Anwendungsgebiete sind zum Beispiel die Prüfung auf Sterilität oder die Bestimmung der Gesamtkeimzahl (TAMC/TYMC).

Im Falle des "Microbial Enumeration Test nach Ph.Eur.2.6.12 heißt es:
"Die Fähigkeit des Tests, Mikroorganismen in Gegenwart des zu testenden Produkts nachzuweisen, muss nachgewiesen werden. Die Eignung muss bestätigt werden, wenn eine Änderung der Testleistung oder des Produkts vorgenommen wird, die sich auf das Testergebnis auswirken könnte."(Übers. Redaktion)

Auch zu den erwarteten Ergebnissen gibt die Ph.Eur. Auskunft:
"Bei der Überprüfung der Eignung der Membranfiltrationsmethode oder der Plattenzählmethode muss eine mittlere Keimzahl aller Testorganismen ermittelt werden, die nicht um mehr als den Faktor 2 vom Wert der in 4-5-2 definierten Kontrolle in Abwesenheit des Produkts abweicht. Bei der Überprüfung der Eignung der MPN-Methode muss der aus dem Inokulum berechnete Wert innerhalb der 95-prozentigen Konfidenzgrenze der mit der Kontrolle erzielten Ergebnisse liegen." (Übers. Redaktion)

Will man also eine solche Arzneibuchmethode etablieren, gilt es eine ganze Reihe von Charakteristika des jeweiligen Testprozederes zu erheben und zu berücksichtigen, z. B.

• die Zusammensetzung des zu testenden Artikels
• die Komplexität der Probenvorbereitung
• die für die Durchführung des Verfahrens erforderlichen Reagenzien
• die für die Durchführung des Verfahrens erforderliche Laborausstattung
• die Laborumgebung

2. Validierung neuer/alternativer Methoden

Was aber, wenn man eine andere als die in der Pharmakopöe aufgeführten Methode einsetzen möchte, weil die genannten Methoden für das eigene Produkt nicht anwendbar sind oder weil eine andere Methode schnellere oder bessere Ergebnisse bringt o. a.?
In einem solche Fall muss natürlich eine vollständige Validierung durchgeführt werden.  Hilfreiche Informationen zu den Anforderungen und zur Durchführung geben hier folgende Dokumente

• Ph. Eur. chapter 5.1.6
• Ph. Eur. chapter 2.6.7
• Ph. Eur. chapter 2.6.21
• USP chapter <1223>
• USP chapter <1227>
• USP chapter <1113>
• PDA Technical Report #33
• PDA Technical Report #50

Den analogen Anforderungen der USP und auch der Ph.Eur. folgend, steht am Anfang in der Regel eine Erstvalidierung/Primärvalidierung, die oft durch oder mit dem Hersteller der jeweiligen Methode durchgeführt wird. Sie dient der Charakterisierung des zugrunde liegenden Detektionsprinzips.

Die weitere Validierung beginnt mit der Definition interner Anforderungen in Form einer URS (User Requirement Specification), auch Lastenheft genannt. Darauf aufbauend ist eine Risiko-Nutzen-Analyse durchzuführen. Diese dient dazu, die Vorteile der alternativen Methode gegenüber der Arzneibuchmethode zu bewerten und mögliche neu entstehende Risiken zu identifizieren. Eine sorgfältig ausgearbeitete Risikoanalyse bildet die Grundlage für die Festlegung der Validierungsparameter und stellt sicher, dass die in der URS definierten Anforderungen eingehalten werden. Entsprechend der etablierten Vorgehensweise umfasst dieser Prozess die vier Qualifizierungsphasen DQ, IQ, OQ und PQ. Die eigentliche Validierung im engeren Sinne erfolgt dann im Rahmen der PQ und umfasst in der Regel die Evaluierung/Prüfung der folgenden Parameter:

Validierungsparameter	Qualitativer Test	Quantitativer Test	Test zur Identifikation
Richtigkeit	+(1)	+	+
Präzision	-	+	-
Spezifität	+	+	+
Nachweisgrenze (LOD)	+	-(2)	-
Bestimmungsgrenze (LOQ)	-	+	-
Linearität	-	+	-
Arbeitsbereich	-	+	-
Robustheit	+	+	+
Suitability Testing	+	+	-
Äquivalenz	+	+	-

Tabelle: Validierungsparameter: - Nicht gefordert + erfordert 1 kann ggf. alternativ zu LOD gemacht werden 2 kann in einigen Fällen nötig sein

Inzwischen finden eine ganze Reihe verschiedener Methoden Verwendung, die Vorteile beim Einsatz in der pharmazeutischen Industrie bieten, z. B. für:

• Schnellere Ergebnisse (Time-to-Result), was zu einer schnelleren Freigabe von Produktionschargen führt.
• Ein verbessertes Prozessverständnis/IPC und Echtzeit-Monitoring, ermöglicht schnelle Reaktion bei Abweichungen
• Automatisierung und daraus folgender Reduzierung manuelle Fehler.

Einige Beispiele für Methoden, die zum Einsatz kommen:

• ATP-Biolumineszenz: Schneller Sterilitätstest.
• Festphasenzytometrie: Schneller Bioburden-Test.
• rDNA 16S-Sequenzierung: Identifizierung von Mikroorganismen.
• PCR (klassisch oder Real-time): Schneller Nachweis.

Wichtig beim Einsatz von alternativen Methoden ist dann noch der Nachweis der Äquivalenz mit den bestehenden Arzneibuchmethoden gefordert, z. B. in Form einer parallelen Prüfung mit der alternativen Methode und der Methode gemäß Arzneibuch. Das Ergebnis muss gleichwertig sein. Das kann z. B. bei einer Keimzahlbestimmung dadurch gezeigt werden, dass kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen beider Methoden vorliegt. Eine Verbesserung kann bei einem quantitativen Test beispielsweise eine höhere Sensitivität sein.
Gerade eine höhere Sensitivität bzw. geringere Selektivität kann bei modernen Methoden eine Herausforderung sein. Die Schwierigkeit bei modernen Methoden die "all viable counts" erfassen ist dabei, dass sie wesentlich mehr Mikroorganismen nachweisen als die klassischen Arzneibuchmethoden, die z. B. auf Grund der z. T. selektiven Eigenschaften der verwendeten Nährmedien und der individuellen Ansprüche der Mikroorganismen immer Lücken bei der wachstumsfördernden Eigenschaften aufweisen, d. h. es wachsen nicht alle Mikroorganismen auf den jeweiligen Nährmedien zu sichtbaren Kolonien heran. Selbst auf Standard/ Universalmedien wie Caso Agar wachsen verschiedene MO wie Haemophilus spp. oder Neisseria spp. schlecht oder gar nicht an. Gleiches gilt für eine ganze Reihe von Pilzen.

Literatur und Quellen

• Ph.Eur. 5.1.6 Alternative Methods for Control of Microbiological Quality, currently under Revision - a Draft General Chapter was published in Pharmeuropa 37.2,
• Ph.Eur. 2.6.7 Mycoplasmas, General Chapter, Adopted 2025, in force April 2026
• Frequently asked questions on chapter 2.6.12 Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests
• United States Pharmacopoeia (USP), chapter <1223>, USP chapter <1227>, USP chapter <1113>;
• PDA Technical Report #33; Evaluation, Validation and Implementation of Alternative and Rapid Microbiological Methods
• PDA Technical Report #50, Alternative Methods for Mycoplasma Testing

Neben den oben genannten Dokumenten gibt es auch eine ganze Reihe von Publikationen zu durchgeführten Validierungen von alternativen Methoden, z.B.:

• A Systematic Approach for the Evaluation, Validation, and Implementation of Automated ColonyCounting Systems, Sven Deutschmann, Bill Carpenter, Caroline Duignan, Chris Knutsen, Joanny Salvas, Lisa Wysocki, Lucile Plourde, Lynn Johnson and Wolfgang Eder, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol. 76, Issue 6, November/December 2022
• Validation of a NAT-based Mycoplasma assay according European Pharmacopoiea, Sven M. Deutschmann, Holger Kavermann, Yvonne Knack, Science Direct, Biologicals, Volume 38, Issue 2, March 2010, Pages 238-248
• Rapid Sterility Test Systems in the Pharmaceutical Industry: Applying a Structured Approach to their Evaluation, Validation and Global Implementation, Sven Deutschmann, Mousumi Paul, Marja Claassen-Willemse, Jonas van den Berg, Pieta IJzerman-Boon, Viviane Grunert da Fonseca, Ellen Brunbech, Lynn Johnson, Chris Knutsen, Lucile Plourde, Joanny Salvas, Philip Villari, Lisa Wysocki and Margit Franz-Riethdorf PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology January 2023
• Validation of Milliflex® Quantum for Bioburden Testing of Pharmaceutical Products, Oliver Gordon, Marcel Goverde, Alexandra Staerk and David Roesti, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology May 2017, 71 (3) 206-224

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